如何提高蛋白質的表達量?

綜合而言,一般用的重組蛋白誘導表達條件是固定的,有時候要追求可溶表達,頂多就調整下誘導溫度(25℃)。條件就是:自動誘導培養基(不用額外的IPTG),37℃,20h。一般來說大分部蛋白的表達量都還可以。
但有些蛋白的表達量不行,或者某些蛋白需要長期大量使用,因此提高這些重組蛋白的誘導表達量就十分有必要了,如果進一步提高呢?
我們都知道,蛋白質的表達量和蛋白質的翻譯效率有關,翻譯效率又跟mRNA的二級結構又有關系,如果mRNA形成了復雜的二級結構,會導致核糖體無法順暢的將整個mRNA讀通,甚至會提前從mRNA上掉下來。一般公司號稱的密碼子優化,也就是通過替換掉一些稀有密碼子,顯然如果不從二級結構上考慮的話,是沒法提高蛋白質的表達量的,而事實也確實如此。在公司做研發的幾年中,做過多個蛋白的密碼子優化(通過全基因合成的方式),結果差強人意。
今天介紹的方法,不是從二級結構上來預測的(據我所知,目前沒有比較準確的方法來預測mRNA的二姐結構),而是一種簡單、高效的方法:通過優化目的基因的5'部分DNA序列,而且不需要通過軟件預測,完全隨機,包含所有可能(理論上),且不改變氨基酸序列。
原理:蛋白質的翻譯效率很大程度上跟翻譯起始效率有關,因此mRNA的5'端必須得很好翻譯,好不要有復雜的二級結構;通過PCR的方法在基因的5‘端引入簡并序列,構建克隆,挑選多個克隆,誘導表達之,SDS-PAGE電泳檢測表達量的高低,挑選高表達克隆進行測序。
實驗步驟:
1.設計目的重組蛋白質的N端10-15個氨基酸的簡并序列。
2.引物合成上述簡并序列,同時設計合成目的基因反向引物。
3.PCR擴展目的基因,這樣在目的基因的5‘端就引入了兼并序列,同時不改變氨基酸序列。
4.雙酶切,插入到目標載體。
5.轉化。
6.挑選多個克?。ū热?00-200個)到1.5ml EP管,直接誘導表達(記得帶上為改造克隆菌株的對照)。
7.SDS-PAGE檢測。
8.挑選高表達的多個克隆,測序。